一种新的蛋白质测序方法，利用生物马达将蛋白质拉过一个微小的纳米孔，可能会给蛋白质分析带来革命性的变化。华盛顿大学的研究人员在单分子分辨率下检测翻译后修饰(包括磷酸化)对全长蛋白质结构的影响方面也取得了重大突破。

　　纳米孔测序技术依赖于细菌蛋白(紫色)通过孔(粉红色)绘制未折叠的多肽链。

　　人类基因组大约有2万个基因，但研究人员已经确定了100万种不同的蛋白质结构或蛋白质形态。这种多样性源于基因突变和翻译后修饰——比如添加化学基团或碳水化合物链——从而改变了蛋白质的功能。这些修饰在调节复杂的生物过程中起着关键作用，也可以影响疾病的发展，包括癌症、阿尔茨海默病和自身免疫性疾病。绘制这种多样性可以极大地增强我们对细胞功能的理解，并为更具体的疾病干预提供机会，但传统方法难以处理蛋白质的三维结构。

　　为了克服这个问题，Jeff Nivala的实验室与牛津纳米孔技术公司合作，开发了一种利用纳米孔传感技术进行全长蛋白质测序的系统。牛津纳米孔公司的一位发言人说:“这项创新技术使研究人员能够读取长而完整的多肽链，为理解复杂的生物过程和疾病提供了新的可能性。”

　　为基因组DNA测序而优化的纳米孔传感技术，其工作原理是利用电场将长生物聚合物通过生物通道——纳米孔。结构变化是通过测量施加在纳米孔上的电流的变化来确定的。由于不同的化学基团导致不同的破坏，这就给了它们一个独特的化学特征，用于解码聚合物序列。

　　在蛋白质通过纳米孔进行测序之前，必须将其二级和三级结构展开。Nivala的团队首先通过附着带负电荷的“尾巴”来修饰感兴趣的蛋白质，当电流施加时，尾巴会将蛋白质吸引到孔中。他们还添加了一个庞大的“阻止”序列，以防止蛋白质完全通过通道。Nivala解释说，这种塞子有一个从大肠杆菌中分离出来的ClpX酶的结合位点，“它有助于‘展开’并将蛋白质拉过纳米孔”。“ClpX有一种独特的步进机制，允许它以大约两个氨基酸的步骤移动蛋白质。“当蛋白质被拉过纳米孔时，通道上的电流振幅会发生变化——这是氨基酸存在的结果。”这些振幅的变化可以用来确定蛋白质的序列。

　　多肽通过纳米孔时电荷的变化可以被检测到，并用于识别哪些氨基酸通过了纳米孔。它还可以检测氨基酸是否发生了任何变化

　　然而，ClpX的活性并非完美无瑕，因为它失去了对某些氨基酸片段的控制。尼瓦拉的团队利用这种明显的缺陷，有策略地将“滑动序列”插入研究人员试图测序的蛋白质链中。尼瓦拉说:“我们可以控制蛋白质运动的速度和方向，使我们能够重新读取部分并提高准确性。”“控制这种运动的能力使我们能够更详细地了解蛋白质的序列。”

　　为了解释电流的变化，研究人员开发了一种名为“aminocaller”的神经网络。为了证明其潜力，他们系统地量化和绘制了295个氨基酸长的蛋白质中酶诱导的修饰，准确度超过98%，并在一次实验中识别出100多种蛋白质变体。伊利诺伊大学(University of Illinois)的阿列克谢·阿克西门耶夫(Aleksei Aksimentiev)没有参与这个项目，他说这是“向前迈出的一大步”。

　　尽管前景光明，但需要将“尾部”序列附加到蛋白质上，并且解释未知序列的当前测量结果的复杂性增加，这对高通量蛋白质测序构成了重大挑战。牛津大学(University of Oxford)有机化学家余佳庆(Yujia Qing)说，我们面临的挑战是制造出任何人都能快速、轻松地使用的东西，而不需要他们具备某种高级专业知识。