曲恩汀或(N,N′-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺(TETA)是一种铜螯合剂，用于威尔森氏病，是一种没有紫外线吸收基团的脂肪胺。本研究采用十二烷基硫酸钠修饰银纳米粒子(AgNPs)，建立了一种定量测定TETA的分析方法。将不同浓度的TETA加入到特定浓度的AgNPs中，在pH、时间、盐和AgNPs体积的最佳条件下，在397 nm处测量每个样品的吸光度。采用响应面法设计实验，对其进行优化。然后，根据TETA溶液浓度与AgNPs吸光度下降的关系，得到校准曲线。所开发的方法的选择性是在等离子体和常见阳离子，即铜，锌和铁的存在下进行的。在最佳条件下，该方法的线性范围为10 ~ 40 ng。mL?1，相关系数(R2)为0.996，检出限和定量限为3 ng。mL?1和10 ng。mL?1。由于建立的基于AgNPs的分析技术的高灵敏度，所建立的方法在通过稀释消除阳离子存在时的选择性。该方法适用于TETA的定量分析，成本低，对仪器要求不高。
曲恩汀的化学名称为三乙基四胺(N,N′-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺，TETA)(图1)，是一种胺类化合物，用于治疗有神经系统症状的严重Wilson患者[1]和肝功能衰竭患者[2,3]，作为青霉胺的替代品。然而，它已被用作治疗严重肝脏或神经系统适应症患者的初始治疗方法[4,5]。铜在TETA中具有与氮结合的配位[6]。研究表明，TETA等铜螯合剂可以通过促进人体铜转运蛋白1 (copper transporter 1, hCtr1)介导的铂摄取，使耐铂的癌细胞重新敏化[7]。此外，该药可用于糖尿病，逆转糖尿病性心力衰竭[8]和肥厚性心肌病[9]。
图1
曲恩汀(三乙烯四胺，TETA)
脂肪族胺(如TETA)的测量存在一些问题，如低紫外线检测是由于缺乏紫外线吸收基团[10]。这个问题通过它们与其他试剂的衍生化解决了。Bauer和Richter提出了仅在碱性溶液中稳定的胺类化合物与水杨醛柱前衍生化生成亚甲基的方法。该方法的主要缺点是耗时(每次分析16 h)和成本高[11]。
已经提出了一些分析TETA作为脂肪胺的方法。但它们大多是复杂的分析方法，灵敏度较低。Nakano等[12]报道了一种基于分子内准分子形成的荧光衍生化方法。该方法将TETA和1,6-己二胺(内标)用芘试剂转化为一致的准分子形成衍生物(4-(1-芘)丁酸n -羟基琥珀酰亚胺酯)。Miyazaki等[13]发展了一种荧光胺衍生物生成法测定TETA的方法。Kodama等人[14]提出了另一种荧光定量TETA的方法，使用HPLC系统结合在线柱后衍生化。该方法灵敏度较前一种方法低，但不需要复杂的制样程序。Hansen等人[15]描述了一种不需要衍生化反应的反相离子配对高效液相色谱和电导率检测方法来测定TETA。他们通过核磁共振(NMR)光谱测定了TETA在环境储存和高压灭菌后的稳定性。2007年，Lu等[16]提出了液相色谱-质谱联用法(LC-MS)检测和定量血浆和尿液样品中的TETA，这是一种耗时且昂贵的常规分析技术。
作为比色探针研究的一组材料是金属纳米颗粒[17,18,19]。这些材料表面带正电荷，可以通过添加不同特性的物质和与纳米颗粒结合的倾向来改变其表面等离子体激元，这一特性可以用于分析药物[20,21,22,23]。银纳米粒子(AgNPs)由于其独特的视觉、电学和化学性质而被用作分析和生物分析传感器。AgNPs的光谱特性取决于它们的形状、大小、环境和纳米颗粒之间的空间，因此，AgNPs的几何形状将控制其视觉特性[24,25]。由于纳米颗粒表面带有负电荷，经十二烷基硫酸钠(AgNPs-SLS)修饰的纳米颗粒可用于测量含有胺基的物质[26]。这些纳米颗粒的稳定性是由于负封盖剂的静电斥力，而不是AgNPs之间的范德华引力[27]。通过在AgNPs表面附着不同的材料，会改变表面等离子体共振(SPR)带，并且由于AgNPs聚集而形成的不同大小的粒子会使颜色从亮黄色转变为其他颜色[28,29,30]。这些细节可以用来分析材料。
本文报道了一种利用改性AgNPs进行紫外光谱检测的廉价快速的TETA测定方法，该方法不需要大型和昂贵的设备。
硝酸银、十二烷基硫酸钠、硼氢化钠、三乙烯四胺(TETA)、硫酸锌(ZnSO4.7H2O)、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)、硫酸铜(CuSO4)、氢氧化钠(NaOH)、SLS和盐酸(HCl)购自默克公司(德国达姆施塔特)。提供了Mojallali博士化学实验室(伊朗德黑兰)的超纯氯化钠。在实验的所有阶段都使用了实验室自制的蒸馏水。调节pH值使用Metrohm Model 744 pH计(Herisau，瑞士)和岛津紫外分光光度计(Analytik Jena AG，德国)进行紫外线测量。采用动态光散射法(DLS, Malvern Instruments, UK)测定纳米颗粒大小。
AgNPs的制备方法参考文献[26]，稍作修改。该方法以NaBH4为还原剂，SLS为稳定剂。取适量NaBH4 (38 mg)和SLS (85 mg)溶于50 mL蒸馏水中，380 rpm搅拌30 min。另取170 mg AgNO3溶于50 mL蒸馏水。然后将AgNO3溶液滴加到NaBH4-SLS溶液中，最终溶液搅拌1小时。制备的AgNPs-SLS在室温(25℃)下保存一周以备分析。最后，将1.5 ml制备的纳米颗粒溶液用蒸馏水稀释于50ml容量瓶中，进行分析。
用DLS对合成的AgNPs进行了表征。所得AgNPs的DLS测量结果如图2所示，制备的AgNPs的平均粒径为6.63±1.82 nm。
图2
合成AgNPs的动态光散射特性
采用响应面法(Box-Behnken)进行试验设计，采用Minitab 17软件进行参数优化。在初步实验的基础上，在软件中输入不同的pH范围(2 [HCl 0.01 M]， 7(水)，12 [NaOH 0.01 M])， AgNPs体积(1-1.5 mL)， NaCl体积(10-50μl, 0.1 M溶液)和时间(5-15 min)，进行了28次实验，得到了最佳条件。
将材料的最佳浓度为1.5 mL AgNPs、0.1 M溶液中10μL NaCl和1 M溶液中200μL HCl(最终pH=2)以及不同浓度的TETA加入到2ml系列微管中。然后，用蒸馏水将混合物稀释至2ml。在397 nm(最大吸收波长)处测定各样品的吸光度，并得到校正曲线(TETA浓度与AgNPs吸光度下降之间的线性范围)。为了验证方法的准确性和精密度，在三种不同浓度的TETA下进行了日间和日间试验。
在铜、锌等常见阳离子存在的生物范围内，考察了所建立方法的选择性。记录不同浓度的TETA对AgNPs吸光度的变化，寻找定量限。选择稀释样品作为一种简单的方法(10倍、100倍、500倍和1000倍稀释)来去除干扰，即阳离子。
无药物血浆样本由伊朗输血研究中心(大不里士，伊朗)提供，并在-4°C冷冻以待分析。三个血浆样品加入不同浓度的TETA(10、20和30 ng.mL?1)。用水稀释1000倍后，按最佳条件进行实验，记录每次实验获得的吸光度，并与水样中的吸光度进行比较。
摘要。
介绍
材料与方法
结果与讨论
结论
数据可用性
参考文献。
作者信息
道德声明
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通过将分析物(TETA)添加到修饰的AgNPs中，会发生聚集，并且根据TETA的浓度观察到不同的颜色(图3)。
图3
添加TETA后AgNPs-SLS聚合及颜色变化
为优化方法，采用响应面法(Box-Behnken)进行了试验设计。将测试过程中的影响参数作为自变量输入到软件中，进行实验。在每个实验的响应中都考虑了样品和空白的吸光度差异(ΔAbsorbance)。表1报告了每次测试的实验基质和获得的吸光度。对结果进行逐步多元线性回归分析，得到方程如下:
表1响应式实验设计采用Nse曲面法求出所研究参数的最优值
ΔAbsorbance=- 1.18 + 0.2575 pH - 0.0068 Time + 0.1306 NaCl - 1.98 AgNPs - 0.01542 phx pH + 1.87 agnpsx AgNPs - 0.01170 phx Time + 0.1244 Time × AgNPs - 0.1045 NaCl × AgNPs。
相关系数(R2)、校正R2和预测R2分别为0.91、0.86和0.71。p值由数据分析得到，如表2所示。除NaCl浓度外，其余参数的p值均< 0.15。结果表明，各参数及其相互作用对吸光度有显著的影响。数据证实，除NaCl浓度对吸光度无显著影响外，各参数对吸光度均有显著影响(p值=0.98)。NaCl存在时，AgNPs的临界凝血浓度(CCC)没有明显升高[31]。然而，它与AgNPs的相互作用参数是实质性的。pH值、时间和AgNPs浓度的对比图如图4所示。结果表明，降低AgNPs的pH值、增加AgNPs的体积和时间可以降低样品的吸光度。SLS可以通过增强负电荷分子(SLS)和致密涂层的静电斥力和空间斥力来提高粒子的稳定性[31]。在低pH下，胺基发生电离;这意味着TETA和SLS之间会有很好的吸引力，所以会发生聚集。在此过程中，带负电荷的TETA被AgNPs表面的正电荷所吸引。具有胺类官能团的各种药物也报道了类似的模式[28,29,30]。因此，各参数的最佳用量为AgNPs 15 mL, NaCl 10μL, pH 2，反应时间15 min。
表2所开发方法的精密度(日间和日间)和准确度
图4
吸光度随研究参数(pH、时间和AgNPs体积)的等高线图
改性AgNPs溶液的紫外可见光谱如图5所示。结果表明，AgNPs的紫外可见光谱随TETA浓度的增加而变化，表明AgNPs的等离子体带受分析物浓度的影响。在较低的TETA浓度下，397 nm处的吸光度略有下降。加入较高的分析物值，吸光度带变弱、变宽;这表明TETA与AgNPs之间已经形成相互作用。
图5
TETA (0-40 ng.mL?1)对AgNPs吸光度的影响
根据优化后的变量进行实验，在10 ~ 40 ng范围内，相关系数(R2)为0.996，线性关系良好。得到TETA的mL?1，公式如下:
ΔAbsorbance=-39.06×Concentration + 2.32。
检测限(LOD)和定量限(LOQ)为3 ng。mL?1和10 ng。mL?1。采用空白标准差(Sb)和标定曲线斜率(m)计算:
LOD=3(Sb.m)， LOQ=10(Sb.m)。
校正曲线数据点的变异系数(CV)即相对标准偏差× 100 (RSD %)和反向计算浓度的相对回收率均小于15%(最后一次数据小于20%除外)。这些数据，证实了10ng。mL?1是定量下限(LLOQ)，这是评价FDA小分子验证方法指南敏感性的推荐参数[32]。
为了测量准确度和精密度，对三种浓度的分析物(15、25和35 ng.mL?1)每天进行两次日间和日间实验，持续三天。如表2所报道的数据，RSD%小于14%;因此，该方法的精度在可接受的范围内。将平均吸光度代入所得方程，计算出浓度。观察到的浓度在标称浓度的91-107%范围内;因此，所开发方法的精度是允许的。结果表明，所建立的方法具有良好的准确度和精密度。
TETA是阳离子螯合剂;因此，有必要检查血液中存在的阳离子的选择性，即威尔逊氏病中积累的铜，威尔逊氏病患者中与TETA共同给药的锌，以及通常存在于血液中的亚铁及其补充剂的常规消耗。首先，在存在阳离子的情况下，评估了所开发方法的吸光度变化。离子浓度的选择是基于它们在血浆中的报告值，即在Wilson患者中，铁170μg/dL[33]，锌1 mg/dL[34]和铜60μg/dL[35]。结果如图6所示。说明阳离子溶液稀释1000倍后，30 ng存在下AgNPs吸光度无显著差异。浓度为mL?1的TETA，稀释10倍、100倍和500倍对吸光度有相当大的影响。这些数据证实了评估阳离子干扰在开发基于AgNPs的分析方法中的重要性。所建立的基于AgNPs的分析技术的高灵敏度及其高剂量给药使得在阳离子和其他具有类似结构的药物(即具有胺官能团结构的药物，如β受体阻滞剂，其血浆浓度低于TETA)存在下稀释1000倍后具有可接受的选择性。
图6
AgNPs在铁(170 μ g.dL?1)、铜(60 mg.dL?1)和锌(1 mg.dL?1)存在下的吸光度变化
为了评估该方法在生物样品中的应用，我们在血浆样品上进行了实验。稀释1000倍后，TETA在水溶液和血浆样品中的吸光度差异为±15%。大剂量给药(> 1g)的Wilson患者血浆TETA浓度比现有方法的灵敏度高约1000倍[1]。因此，通过稀释样品，TETA浓度仍然会高于所建立方法的灵敏度。
由于TETA结构中缺乏紫外吸收基团，很难取紫外光谱;因此，人们采用高效液相色谱法测定胺类化合物，即荧光法、电导法和LC-MS法。采用电导率检测分析TETA;然而，这种方法的局限性阻碍了这些化合物在复杂生物基质中的后续研究的应用。使用TETA柱前衍生化的荧光法灵敏度更高，但需要在分析前对样品进行精心制备。高效液相色谱-紫外系统耦合柱后衍生的TETA，似乎适用于临床使用;然而，灵敏度低于以前的荧光法。LC-MS法测定血浆和尿液中的TETA具有适当的灵敏度，可以测定TETA的两种代谢物，但将该方法发展到大规模临床分析还存在一些问题[13,14,15,16]。
由于TETA不含发色团，故未采用紫外光谱法测定TETA。采用AgNPs法分析血浆中TETA，与HPLC法相比，该方法简便，不需要高设备，15分钟内即可完成分析。表3对不同检测器的色谱技术不同方法的比较表明，本研究建立的方法具有较高的灵敏度。紫外分光光度法是一种简便易行的仪器分析方法，可用于分析彩色样品。此外，RGB加色模型等图像分析方法可用于TETA分析的数字图像比色法。然而，线性范围窄，AgNPs的稳定性和方法的选择性，特别是在复杂基质中具有类似结构的阳离子和药物存在时，是该方法的局限性。
表3与其他已开发的TETA定量方法的比较
本文介绍了一种基于AgNPs-SLS的紫外分光光度法测定无发色团药物TETA的分析方法。与其他TETA定量方法相比，该方法的准确度和精密度可接受，运行时间短，可在15 min内处理。无需复杂的制备，如血浆蛋白的提取或沉淀，以减少对方法的干扰。由于已建立的基于AgNPs的分析技术具有很高的灵敏度，因此可以通过稀释消除血浆中蛋白质和阳离子的干扰。然而，在分析复杂矩阵时，应考虑该方法的选择性。
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