胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)对大脑正常发育至关重要，并调节血管成熟和稳定的重要过程。重要的是，与子宫内水平相比，早产与血清IGF-1水平降低有关。利用兔早产幼犬模型，我们研究了重组人IGF-1及其主要结合蛋白igf -结合蛋白3 (BP-3)复合物经脉络膜丛摄取到脑实质的情况。皮下给药5小时后，标记的rhIGF-1/rhIGFBP-3广泛存在于侧脑室和第三脑室的脉络膜丛，然而，在第四脑室以及血管周围和蛛网膜下腔的程度较低。我们发现脑脊液中IGF-1的摄取具有时间依赖性，随着出生年龄的增加而减少，并且IGF-1通过脉络膜丛易位。全身rhIGF-1/rhIGFBP-3对脉络膜丛IGF-1受体激活的影响随着出生年龄的增加而降低，这与脑脊液中IGF-1的摄取有关。此外，脉络膜丛基因表达随出生年龄增加而增加。此外，利用体外培养的脉络膜丛细胞，进一步研究了rhIGF-1/rhIGFBP-3刺激与单独rhIGF-1刺激相比，基因表达和蛋白质合成没有差异。在这里，我们描述了系统性rhIGF-1/rhIGFBP-3对早产儿大脑的摄取，并表明系统性rhIGF-1/rhIGFBP-3与脉络膜丛之间的相互作用随着时间的推移而变化。
促有丝分裂肽胰岛素样生长因子1 (IGF)参与细胞代谢和血管生成的调节，是胎儿大脑发育的重要元素[1,2]。与相应胎龄的胎儿相比，早产后血清IGF-1水平明显较低[3,4,5]。产后血清IGF-1水平降低与神经发育障碍的风险升高、体重增加不佳和脑容量减少有关[5]。为极早产儿(即小于妊娠28周出生的婴儿)补充重组人(rh) IGF-1结合rhIGF结合蛋白-3 (BP-3)，旨在使健康胎儿的循环浓度保持在正常的宫内范围内，导致严重脑室内出血(IVH)的发生率降低[6]。尽管一系列临床观察性研究[7]的结果表明，用IGF-1辅助治疗可能会潜在地降低包括IVH在内的脑部发病率，但IGF-1介导的对未成熟大脑的保护作用的分子机制仍有待充分阐明。
胰岛素被认为是通过血脑屏障进入大脑的，而IGF-1则被认为是通过脉络膜丛(ChP)的血脑脊液(CSF)屏障进入大脑的[2,8]。ChP战略性地位于大脑的每个脑室中，调节脑脊液的产生，脑脊液反过来为中枢神经系统(CNS)提供营养和血源性信号分子，并提供足够的冲击吸收。全身IGF-1通过ChP的选择性胞吞作用被认为与在ChP中大量表达的IGF-1受体(IGF-1R)有关[9]。然而，在早产兔幼犬的未成熟大脑中，IGF-1R主要位于ChP的上皮边缘，因此面向CSF，并且在内皮侧较少[3]。因此，除了IGF-1R参与外，有理由考虑其他可能的IGF-1通过ChP进行胞吞作用的机制，如细胞外囊泡包封。此外，在出生后4小时，IGF-1R在早产兔的大脑中大量分布。然而，除了ChP外，IGF-1R的存在在出生后96小时显著减少[3]。因此，我们的目的是研究IGF-1从循环到脑脊液的摄取是否遵循与早产兔大脑中IGF-1R分布相同的时间模式。
在这里，我们使用了一个早产兔幼犬模型，幼犬在受孕后第29天(31-32天)通过剖宫产(c.s)分娩，以表征全身rhIGF-1/rhIGFBP-3与ChP之间的相互作用，以及皮下(s.c)给药后全身IGF-1向大脑的摄取。兔已被广泛用于模拟IVH、脑瘫和缺氧缺血的临床前研究[10]，而且兔早产幼仔具有人类早产儿的许多重要生理特征，包括IGF-1水平降低、发生坏死性小肠结肠炎样疾病的风险以及表现出肾脏不成熟[10,11]。此外，由于兔的大脑在围产期发育，其颞白质发育与人类相当[10]，而且与啮齿动物相比，其大脑结构更为复杂[12]，因此，兔还可以弥补人类与啮齿动物之间的翻译差距。
在本研究中，研究了IGF-1对未成熟脑ChP的影响，并对rhIGF-1/rhIGFBP-3进行了体外注射。我们观察到，给药时间点的出生年龄影响循环和CSF中IGF-1的浓度，以及ChP中IGF-1R的激活。最后，体外研究表明，rhIGF-1/rhIGFBP-3复合物和非复合物的rhIGF-1对ChP上皮的作用相似。
动物实验方案经隆德瑞典动物伦理委员会批准(Dnr: 5.8.18-06020/2019和5.8.18 - 11990 /2021)。我们按照前面的描述[13]，使用了成熟的兔胎早产模型。使用新西兰白(Egle Kergiene, Lundsbrunn，瑞典)。短句来源本实验选取43窝(母窝92窝，公窝63窝)的155只兔仔，于第29天(足月31 ~ 32天)静脉注射丙泊酚-利普罗(20 mg/ml静脉滴注，德国B. Braun Melsungen AG, Melsungen)。出生后，幼崽由动物实验室的工作人员处理和护理。将幼崽晒干并置于30°C和60%湿度的婴儿培养箱中。在约。1-2小时时，称重、标记幼崽，并用4根法国饲管(Vygon, Ecouven，法国)手工喂养牛初乳(100 ml/kg/天，Biodane Pharma, Gesten，丹麦)。12 h时，幼崽接受牛初乳和Fox Valley 30/50(荷兰鹿特丹Melk voor Dieren)的混合物(1:1,v/v)。从24小时开始，幼崽只得到狐狸谷的30/50。狐谷30/50的给药量每24 h增加10 ml/kg/d。12、36、60 h时的喂养减少到之前相应剂量的一半，即12 h时50 ml/kg(相当于出生时100 ml/kg的一半)等。根据需要，每天轻轻地清洁幼犬一次或两次，以保持卫生。
图1A概述了实验装置的示意图，包括所使用的技术。
标记rhIGF-1/rhIGFBP-3在早产兔幼崽未成熟脑内摄取的表征
1 ~ 2 h时，按平均体重、产仔数等随机分组。在大约24小时时，幼犬接受s.c.注射生物素(n=9)、FITC (n=2)或Alexa Flour (AF) 647 (n=4)标记的rhIGF1/rhIGFBP-3(给药总剂量为8 mg/kg，由0.116 mg生物素、FITC或af647标记的rhIGF-1/rhIGF-BP-3和0.1-0.2 mg未标记的rhIGF-1/rhIGFBP-3组成，详见“标记rhIGF-1/rhIGFBP-3”一节)或载体。如“组织收集和处理”一节所述，将动物终止，注射后5小时，用多聚甲醛(PFA)灌注大脑，解剖并随后使用透射电子(TEM)，共聚焦显微镜和光片显微镜进行分析(详见“组织收集和处理”，“免疫荧光显微镜和免疫组织化学”，“光片显微镜”和“电子显微镜”)。
IGF-1免疫反应性及co的表征未标记的rhIGF-1/rhIGFBP-3给药后脑脊液和血清中的浓度
出生后立即将幼崽随机分为0、3、24、72 h 4组(0、24、72 h组，每组n=22-24;组3 h, n=4)，并在各自相应的时间点，接受8 mg/kg未标记的rhIGF-1/rhIGFBP-3的s.c注射(根据武田制药有限公司，Boston, MA, USA的描述，在车液中供应和制备)。幼犬随访4 (3 h组)或5 h(0、24和72 h组)，随后终止，收集脑进行IGF-1免疫反应性分析(详见“组织收集和处理”和“免疫荧光显微镜和免疫组织化学”章节)，提取ChP组织检测IGF-1R活化和基因表达(详见“组织收集和处理”，“兔ChP组织蛋白提取”章节)。“Western blot分析、RNA分离和qRT-PCR/基因阵列分析”)，收集CSF和血液以测定两种液体中的IGF-1浓度(详见“组织收集和处理”和“IGF-1浓度”章节)。
注射3小时组的动物，在7小时终止，从最初的中试研究中获得。随后，由于实验条件的原因，对研究设置进行了小幅调整。没有观察到这对数据有任何重大影响。
除上述实验设置外，还使用其他幼崽建立实验程序，包括IGF-1R激活、免疫组织化学、免疫荧光和免疫金标记。这些幼崽不包括在实验组中，但包括在上述报告的动物总数中。
在这项工作中报告的所有幼崽的性别是通过耳朵活检确定的，如“性别确定”一节所述。性别测定是回顾性进行的，并不是将动物分配到不同实验组的一部分。观察到兔仔总数和实验组的性别分布相似，详见附加文件1:表S1。
根据制造商的说明，使用Alexa Fluor?647偶联试剂盒(Fast, Lightning-link?，ab269823, Abcam, Cambridge, UK)、生物素偶联试剂盒(Fast, A型，Lightning-link, ab201795, Abcam)和FITC偶联试剂盒(Fast, Lightning-link, ab188285, Abcam)进行rhIGF-1/rhIGFBP-3的AF647-、生物素和FITC偶联试剂盒(Fast, Lightning-link, ab188285, Abcam)(由武田制药有限公司，Boston, MA, USA提供并在车辆溶液中制备)。对于所有标记方案，使用rhIGF-1/rhIGFBP-3推荐蛋白浓度的25%(根据制造商的建议)。
Western blot分析，将幼崽斩首，立即采集血液(用于IGF-1分析)和ChP。热电联产在液氮中快速冷冻，随后转移到干冰中。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法，用肌内注射氯胺酮麻醉幼鼠。(50 mg/ml, Intervet AB，斯德哥尔摩，瑞典)和Rompun vet。(20mg /ml, Bayer Animal Health，勒沃库森，德国)与异氟烷吸入(Attane vet, 1000mg /g, VM Pharma AB，瑞典斯德哥尔摩)联合使用。镇静后，使用30号注射器从颈部、第四脑室基底池取样CSF(约20-70μl，用于IGF-1分析)，转移到1.5 ml离心管中，目测检查粘着性出血(排除注射器针头插入引起的血液污染)，1000 xg离心10分钟。收集上清并转移到新鲜的1.5 ml离心管中，快速冷冻。并保存在-80°C，直到进一步分析如下所述。通过心脏穿刺收集血液样本(用于IGF-1分析)，1000 xg离心10分钟，用于血清和血浆制备，在干冰上快速冷冻并保存在-80°C，以待进一步分析，如下所述。收集耳朵活检(用于性别测定)，并在干冰上快速冷冻，保存在-80°C，直到进一步分析，如下所述。随后经心灌注新鲜制备的磷酸盐缓冲液(PBS, 0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4，含肝素1000 IU/ml)，并从颅骨中提取脑。收集感兴趣的区域ChP，在干冰上快速冷冻并保存在-80°C，直到进一步分析，如下所述(见“RNA分离和qRT-PCR/基因阵列分析”一节)。免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、透射电镜(TEM)和薄层显微镜下，按上述方法麻醉兔仔，随后经心灌注新鲜制备的PBS(含肝素1000 IU/ml)，然后灌注新鲜制备的4% PFA (VWR Chemicals, Leuven, Belgium，用PBS缓冲，pH 7.4)。固定后，将脑从颅骨中取出，用4% PFA浸泡后固定。6-8小时后更换为新鲜的PFA，然后在4°C下将脑浸入PFA共24小时，然后转移到PBS中进行进一步处理，详见下文各部分。
pfa固定的脑在分级乙醇系列(70-99.99%)中脱水，以二甲苯(100%)结束，随后浸泡在石蜡中并包埋在石蜡块中。在旋转切片机上(Microm HM 360, Microm International GmbH, Walldorf, Germany)制备冠状和矢状石蜡切片(4或6 μm)。冷冻包埋时，pfa固定的脑在PBS (pH 7.4)中冲洗，随后浸泡在防冻液(蔗糖10%和20%)中，然后用OCt在模具中冷冻(Histolab, Gothenburg, Sweden)。冷冻切片(10 μm)在冷冻切片机(Leica CM3050 S, Wetzlar, Germany)上制备。所有切片收集在显微镜载玻片上(SuperFrost Plus, Thermo Scientific/Gerhard Menzel B.V. & Co.，德国布伦瑞克)。
对于IGF-1R和IGF-1的IF双标记，在含有0.05% Triton X-100 (TX)的PBS中清洗去石蜡和再水合的切片，然后在PBS-TX和1%牛血清白蛋白(PBS-TX-BSA)中阻断，室温下30分钟。切片与抗IGF-1R(山羊多克隆IgG, 2μg/ml，稀释于PBS-TX-BSA, AF-305-NA, R&D System, McKinley Place, MN, USA)和IGF-1(小鼠单克隆IgG, 2μg/ml，稀释于PBS-TX-BSA, AM33345PU-S, Origene, Herford, Germany)的一抗混合物在4°C下孵育16小时。在PBS-TX中冲洗后，切片在室温下与AF488偶联抗山羊IgG二抗(IGF-1R)和rhodaminerx偶联抗小鼠IgG抗体(IGF-1，均来自Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA, 1:20 00在PBS-TX中稀释)的混合物孵育45分钟。切片在PBS- tx中冲洗，在4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)中室温孵育15分钟，然后在PBS中冲洗，并在抗褪色溶液(Abcam)中固定。使用对照切片设置荧光检测水平的背景阈值水平，用于共聚焦激光扫描分析和成像(蔡司LSM 800，蔡司，德累斯顿，德国)，使用x20干透镜或x40油浸透镜。进行顺序扫描，优化每个通道的针孔尺寸。为了检测体内给药生物素和fitc偶联的rhIGF-1/rhIGF1BP-3，注射动物和非注射动物的冷冻切片在室温下用Streptavidin AF647 (JIR 15095, Jackson ImmunoResearch, 2μg/ml, PBS-TX稀释)孵育45分钟，或在室温下用抗fitc(小鼠单克隆IgG, ab10257, Abcam, 5μg/ml, PBS-TX稀释)孵育60分钟。为了显示FITC/anti-FITC，切片与AF488 (Jackson ImmunoResearch, 1:20 00 PBS-TX稀释)偶联的抗小鼠IgG在室温下孵育30分钟。为了将IGF-1或CD31与生物素和fitc偶联的rhIGF-1/rhIGF1BP-3一起双重标记，冷冻切片与抗IGF-1(如上所述，4μg/ml, PBS-TX稀释)或CD31 (AF3628, R&D, 7μg/ml, PBS-TX稀释)在室温下孵育60分钟。IGF-1如上所示，CD31用af488结合的二抗(驴抗山羊，Jackson ImmunoResearch 705-546-147, PBS-TX稀释1:20 00)孵育可见。为了同时显示生物素偶联的rhIGF-1/rhIGF1BP-3，以及IGF-1或CD31的免疫标记，标记的切片用链亲和素AF647孵育。如上所述进行共聚焦激光扫描显微镜，使用从非注射动物切片和阴性对照切片(排除平行切片的一抗孵育)中获得的检测水平阈值设置。
对于IGF-1免疫反应位点的显色显示，采用镍离子增强免疫反应。切片去石蜡和再水化，从二甲苯开始，然后是分级乙醇系列，最后在PBS (pH 7.4)中结束。然后将切片(4-6 μm)在过氧化氢(0.1%)中淬火10分钟，以检测内源性过氧化物酶活性，然后在PBS-TX-BSA中室温孵育30分钟。切片用IGF-1一抗(如上所述，2μg/ml，用pbs - tex - bsa稀释)在4℃下孵育16小时。PBS-TX冲洗后，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗(山羊抗小鼠IgG, K4001, DAKO Envision, Agilent, Santa Clara, CA, USA，用PBS-TX- bsa 1:1稀释)在室温下孵育30分钟。HRP偶联物在含有二氨基联苯胺(0.5 mg/ml, Sigma D5637, Merck, Solna，瑞典)、过氧化氢酶(0.1%，Millipore 107,298, Merck, Solna，瑞典)和镍离子(0.125%六水硫酸镍铵，A1827, Merck, Solna，瑞典)的PBS溶液中室温反应10分钟。切片在PBS中冲洗，脱水(分级乙醇，以100%二甲苯结束)，装封(Pertex, histalab, Gothenburg, Sweden)，并滑动盖。在明场显微镜(Olympus IX73, Shinjuku, Tokyo, Japan)下分析和成像染色原标记的冠状面和矢状面切片。
所有抗体孵育均在湿室中进行。标记对IGF-1R和IGF-1的特异性通过标记在兔和人胎盘组织(即阳性对照组织)中的分布得到证实，包括(在所有试验中)省略了一抗孵育(阴性对照)，并且在兔脑中采用了与先前报道相对应的标记模式[3]。省略抗体孵育，标记毛细血管内皮细胞，证实CD31抗体特异性。通过使用共聚焦显微镜阈值设置来建立对给药生物素和fitc共轭rhIGF-1/rhIGF1BP-3的特异性检测，该阈值设置仅显示从非生物素和非fitc共轭rhIGF-1/rhIGF1BP-3处理动物以及未处理和处理动物的阴性对照切片获得的强信号(高于背景水平)。
提取的pfa固定的脑转移到分级甲醇系列中，以PBS结束(pH 7.4，每一步1小时，然后是100%甲醇过夜)。脑在67%二氯甲烷(DCM, Merck, Solna, Sweden)和33%甲醇中孵育24 h(摇匀)，然后在100% DCM中洗涤2 × 15 min(摇匀)。随后，脑在肉桂酸乙酯(EtCinn，默克，索尔纳，瑞典)中孵育24小时。最后，脑储存在新鲜的EtCinn中。光片显微镜使用超显微火焰光片显微镜(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach，德国)进行。
提取的兔ChP固定于2.5%戊二醛(Merck) 0.15 M乙酸钠溶液(pH 7.4, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)中，包埋于Epon(琼脂科学有限公司，Stansted, Essex England)中，并进行超声检查。样品用超碘酸钠进行抗原提取，随后用抗fitc一抗(小鼠单克隆IgG, Abcam, ab10257, 1 ug/ml，用0.2% Aurion BSA (Aurion, Wageningen，荷兰)在pH 7.6的PBS中稀释)孵育，然后用种特异性二抗-金偶联物(EM山羊抗小鼠IgG 15nm Gold, BBInternational, Cardiff, UK)检测。切片用醋酸铀酰(0.5%，Laurylab, Saint Fons, France)和柠檬酸铅(3%，Laurylab)染色。兔ChP在FEI Technai Biotwin 120kv透射电镜下进行检测，加速电压为100kv。使用分辨率为2048 × 2048像素的侧装Olympus Veleta相机(FEI, Hillsboro, OR, USA)记录图像。
动物方案由瑞典隆德的瑞典动物伦理委员会批准(Dnr. 5.8.18-12,930/2019)。原代小鼠ChP上皮(ChPE)细胞培养研究如前所述[14]。简单地说，在解剖显微镜(Nikon SMZ800N Stereomicroscope, Tokyo, Japan)下，从出生后3-6天的小鼠幼崽(C57Bl/6Ncrl, Scanbur, Karlslunde, Denmark)中分离出侧脑室和第四脑室的ChP。收集的ChPE细胞用2 mg/ml pronase(分离自Streptomyces griseus, Merck, Burlington, MA, USA)的酶促反应消化。添加过量的完全DMEM-F12细胞培养基(Gibco, Waltham, MA, USA)，其中含有10%胎牛血清(FBS, Gibco)和1%抗生素-抗真菌药(Gibco)，终止消化。然后将细胞离心1000 xg 2分钟，在完成的DMEM-F12培养基中重悬，并在24孔板上(2*105个细胞/孔)(Fisher Scientific, Gothenburg, Sweden)。为了确保成纤维细胞污染最小，48小时后将细胞培养基更换为含有阿拉伯糖胞嘧啶的DMEM-F12培养基(Ara-C，默克公司)。此后每48 h更换一次完整的DMEM-F12培养基，直到ChPE细胞达到约。90%汇合，8-10天。细胞在37℃、5% CO2中培养。
当ChPE细胞培养达到约90%的融合度时，将细胞血清饥饿1-2小时，然后将细胞暴露于rhIGF-1/rhIGFBP3, rhIGF-1或对照组，将细胞培养基改为含有0% FBS的DMEM-F12培养基。随后，用无血清细胞培养基洗涤细胞，然后在37℃、5% CO2中分别用rhIGF-1/rhIGFBP3 (300 ng/ml，对应60 ng/ml IGF-1，用美国波士顿武田制药有限公司提供的dmemm - f12细胞培养基制备)、rhIGF-1 (60 ng/ml，用美国波士顿武田制药有限公司提供的dmemm - f12细胞培养基制备)或仅用fmemm - f12细胞培养基(对照)孵育15 min、2和3.5 h。为了进行蛋白质分析，用冷水PBS (pH 7.4)洗涤细胞，在60μl裂解缓冲液(1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM na - pyrophosphate, 0.27 M蔗糖，50 mM NaF, 50 mM Tris-base, 1 mM na - orthovanadate和1% w/v NP40)中孵育，其中含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1 mM二硫代索糖醇(DTT)，刮擦后转移到离心管中，在4°C下以15,000 xg离心15分钟。随后，将上清转移到新的试管中，并在-80°C下保存，直到进一步分析，如下所述。为了提取总RNA，细胞在300μl QIAzol (Qiagen, Alden, Germany)中孵育，并根据制造商的说明进行进一步处理。
利用RNeasy Midi Kit (Qiagen)从兔ChP组织中分离RNA。RNA纯度和浓度采用量子比特荧光定量法(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测定。使用500 ng RNA作为逆转录反应模板，根据制造商的说明使用iscript RT试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)进行。利用Bio-Rad的引物PCR技术，分析甲状腺转甲状腺素(TTR, qOcuCID0013554)、正突同源框2 (OTX2, qOcuCED0010795)、骨形态发生蛋白4 (BMP4, qOcuCED0010761)、叶酸受体1 (FOLR1, qOcuCID0014000)、白蛋白(ALB, qOcuCID0005559)、骨形态发生蛋白7 (BMP7, qOcuCED0016395)、水通道蛋白1 (AQP1, 330,001)、水通道蛋白5 (AQP5, qOcuCED0015146)和转化生长因子β (TGF- β)的基因表达。qOcuCID0002132)通过与iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)混合进行测序。按照制造商(Bio-Rad)的描述，在CFX Connect热循环器(Bio-Rad)中进行40个循环的放大，并使用CFX Maestro Software (Bio-Rad)分析数据。数据采用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1 (HPRT, qOcuCID0004422)归一化处理，并通过0 h龄未处理幼犬的ChP归一化处理，采用2?ΔΔCT方法测定折叠变化表达。
利用RNeasy Mini Kit (Qiagen)从原代小鼠ChPE细胞中分离RNA，使用量子比特荧光定量(Thermo Fisher Scientific)测定RNA的纯度和浓度。
在所有实验条件下，以1μg RNA为模板进行逆转录反应(RT2 First Strand Kit)，评估84个血管生成相关基因(RT2 Profiler PCR Array, Mouse angiogenesis, PAMM-024Z, Qiagen)的表达。试剂盒)。采用RT2 SYBR Green qPCR Master mix (Qiagen)定量mRNA表达。按照制造商(Bio-Rad)的描述，在CFX Connect热循环器(Bio-Rad)中进行40个循环的放大，并使用CFX Maestro Software (Bio-Rad)分析数据。将数据归一化为RT2 Profiler Array中包含的β-肌动蛋白(ActB)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，并使用2?ΔΔCT方法通过对未处理细胞的ChPE细胞进行归一化来检测fold change表达。
使用人IGF-1 ELISA (Mediagnost, Reutlingen, Germany)根据制造商说明测定血清和脑脊液中IGF-1的浓度。
将冷冻钢珠(Qiagen)与ChP组织放在干冰上的样品管中。180μl冷完全裂解缓冲液(如上“ChPE细胞培养物的暴露”一节所述)，含有蛋白酶抑制剂混合物和1mm DTT。使用TissueLyser LT 2 (Qiagen)在50 Hz下破坏组织2分钟，然后在冰上孵育5分钟。随后，样品在4°C下离心15,000 xg 15分钟。将上清液转移到一个新的试管中，并在-80°C保存，直到进一步分析，如下所述。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)如前所述[15]，使用预制无染色的4-20%凝胶(Mini-Protean TGX, Bio-Rad)对与样品缓冲液(Bio-Rad)混合并热变性的样品进行电泳。蛋白大小采用Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards (Bio-Rad)测定。凝胶进行电印迹(Transblot?Turbo, Bio-Rad)，转移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上后，膜在阻断液(5%脱脂干牛奶，Bio-Rad，含0.05% Tween的PBS, PBS- t)中孵育，然后用小鼠磷酸化akt /PKB抗体(Proteintech, 66444-1-Ig, Rosemont, IL, USA, 1:2000，在5%脱脂干牛奶中PBS- t稀释)或磷酸化erk1 /2 (Invitrogen, 14-9109-82, Waltham, MA, USA)。用5%脱脂干牛奶1:500稀释PBS-T)，或兔原代phospho-AKT/PKB (Thermo Fisher, 44-621G)， phospho-ERK1/2 (Cell Signaling Technology, 9102, Danvers, USA)。所有兔一抗在PBS-T中以1:1000稀释在5%脱脂牛奶中。山羊抗小鼠IgG HRP (Dako, Glostrup，丹麦);小鼠一抗)或猪抗兔IgG HRP (Dako;兔一抗)，用PBS-T在1%脱脂干牛奶中稀释1:1700作为二抗。使用Clarity Western ECL底物(Bio-Rad)检测酶标物信号。用小鼠抗肌动蛋白一抗(Abcam, ab6276)或兔抗肌动蛋白一抗(Abcam, ab213262)对β-肌动蛋白进行重新印迹，两者在1%脱脂干乳中稀释为1:5000，加入PBS-T。二抗采用山羊抗小鼠或猪抗兔IgG-HRP (Dako，在PBS-T中1%脱脂乳中稀释1:1700)。利用Clarity Western ECL底物(Bio-Rad)检测酶标物的信号。使用ChemiDoc?MP系统(Bio-Rad)对膜和凝胶进行成像和分析。
样品，60μl，如上所述“ChPE细胞培养的处理和裂解”制备，用二硫苏糖醇还原至终浓度为10 mM，在56°C下加热30分钟，然后在室温下黑暗中用碘乙酰胺烷基化至终浓度为20 mM，持续30分钟。样品用低温乙醇(乙醇最终浓度90%)在-20℃下沉淀过夜，然后在14000 x g下离心10分钟。将颗粒风干，用100μl 100 mM碳酸氢铵重悬，并使用Bioruptor (Diagenode)进行超声处理，30个循环(开20秒，关20秒)。在280 nm处使用NanoDrop (DeNovix DS-11, DeNovix Inc;Wilmington, DE, USA)。以1:50的比例加入胰蛋白酶进行消化(测序级修饰胰蛋白酶，第1部分)。V511A, Promega)加入样品，37℃孵育过夜。用5μl 10%三氟乙酸停止消化。样品在2% ACN, 0.1%的溶液中快速Vac至干燥。提取的肽在Exploris 480质谱仪(Thermo Fischer Scientific)和Vanquish Neo UHPLC系统(Thermo Fischer Scientific)上进行分析。高效液相色谱系统采用两柱结构，肽段被送入Acclaim PepMap 100 C18预柱(75 μm x 2 cm, Thermo Fisher Scientific)，然后在EASY喷雾柱(75 μm x 25 cm, C18, 2 μm, 100 ?， ES902)上分离，流速为300 nl/min。柱温设置为45℃。用溶剂A (0.1% FA溶于水)和溶剂B (0.1% FA溶于80%乙腈)从溶剂B的5%到25%建立120 min非线性梯度100 min，增加到32% 12 min，然后增加到45% 8 min洗脱多肽。样品在阳性模式下用数据依赖采集(DDA)进行分析。全质谱1 (MS1)分辨率设置为12万m/z 200，归一化AGC目标设置为300%，最大进样时间为45 mseconds。全质量范围设置为350-1400 m/z。前驱体以1.3 m/z的隔离窗被隔离，并以30的归一化碰撞能量被HCD破碎。质谱2 (MS2)在轨道rap中被检测到，分辨率为15000。归一化AGC目标和最大注射时间分别设置为100%和自定义。前驱体选择的强度阈值为1e4，采用60 s动态排除。
使用Proteome Discoverer?2.5软件(Thermo Fisher Scientific)分析原始DDA数据，使用SEQUEST HT对UniProtKB小鼠规范数据库(UP000000589)和人类IGF-1 (P05019)和IGFBP-3 (P17936)的fasta文件进行肽鉴定。采用以下参数进行搜索:半胱氨酸的氨基甲基化作为静态修饰，n端乙酰化和蛋氨酸氧化作为动态修饰。前体公差设置为10 ppm，碎片公差设置为0.02 ppm。最多允许遗漏2个裂解，使用Percolator进行肽验证，q值最高为0.01。提取的多肽采用无标记相对定量法进行鉴定和定量。提取的色谱强度用于比较样品之间的肽丰度。
用r包NormalyzerDE对肽强度进行归一化处理[16]。采用标准化中位数。对缺失值进行过滤，使每个蛋白质在每组中至少有4个4值。对所有治疗组的总肽丰度进行两两比较。以样品组、蛋白质类型及其相互作用为自变量，采用线性模型分析蛋白质的差异表达。使用emmeans软件包指定各组(rhIGF-1/IGFBP-3和rhIGF-1与对照组)之间的对比[17]，然后进行log2转换，随后以95%置信区间报告。调整后的p值采用Benjamini-Hochberg法计算，q值为0.05。此外，95%置信区间不为零的蛋白质被认为是差异丰富的。富集分析通过在基因本体(GO)、David和STRING数据库中搜索Reactome通路和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路进行[18,19,20]。
兔性别的确定是通过使用PCR和凝胶电泳可视化方法确认兔基因组中存在性别决定区Y基因(基因ID: 100,328,958)进行的，方法如前所述[3]。简单地说，根据制造商的说明，使用dnasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从耳朵活检中提取DNA。PCR反应使用1μl DNA(范围:100-200 ng/μl)，在57°C下进行30个循环，引物为:正义:TGCAATACAGGAGGAACACG，反义:AGCAAACTGTCGCTCTTCTG。在大约299 bp处存在一条条带，确定该动物为雄性，而没有相应的条带确定该动物为雌性。
统计显著性采用单因素方差分析(single -way ANOVA)计算，对多重均值比较采用事后检验(post hoc Tukey)，对两两比较采用学生t检验(Student’s t test)计算。p值< 0.05为显著性。数据以平均值±标准差表示(另见相应的图例以了解更多细节)。采用R版本4.0.3进行统计分析。
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